熒光顯微鏡是指將紫外線作為光源,使其照射在樣品上,并使得樣品發(fā)光,從而實(shí)現(xiàn)觀察的一種顯微鏡,用于生物領(lǐng)域中研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等的工具。
熒光顯微鏡有兩個(gè)關(guān)鍵的概念,其一是放大倍數(shù),其二是分辨率。
熒光顯微鏡放大倍數(shù)在熒光顯微鏡的觀察應(yīng)用中,為了獲得良好的結(jié)果,用戶需要對顯微鏡的放大倍數(shù)有一定的了解,顯微鏡的放大倍數(shù)就是指在我們在顯微鏡下觀察一個(gè)樣品時(shí),成像之后比原本放大了多少。
而在熒光顯微鏡中,分辨率剛好與其相反,實(shí)際意義上的分辨率指的是樣品成像之后,圖片能夠呈現(xiàn)出樣品的多少細(xì)節(jié),這可能是主觀的,在技術(shù)層面上,分辨率受到光的折射特性的限制。
熒光顯微鏡還有一個(gè)概念是級限分辨率,它指典型的落射熒光照明復(fù)合顯微鏡無法分辨或區(qū)分距離小于200nm的兩個(gè)物體。此外,因?yàn)檎麄€(gè)樣品被同時(shí)照射,所以樣品中所有聚焦和離焦的光線都被檢測到。這些限制意味著,根據(jù)物鏡中的鏡片,可能能夠確定一個(gè)細(xì)胞中的兩個(gè)不同顏色的探針,但是如果沒有很多對照、單像素分析和計(jì)算,就無法分辨它們之間的空間關(guān)系。
熒光顯微放大倍數(shù)與標(biāo)尺之間的對應(yīng)關(guān)系
50x標(biāo)尺每一格代表20μm
100x標(biāo)尺每一格代表10μm
200x標(biāo)尺每一格代表5μm
400x標(biāo)尺每一格代表2.5μm
500x標(biāo)尺每一格代表2μm
1000x標(biāo)尺每一格代表1μm
熒光顯微鏡的物鏡放大倍數(shù)允許有5%的誤差,所以使用前需要校準(zhǔn),步驟是:把物鏡測微尺(劃分為100小格,0.01mm/格)放在載物臺上,然后用相應(yīng)倍率的物鏡和10*刻度目鏡(內(nèi)有0.1mm格值的刻度尺)調(diào)焦成象后,進(jìn)行觀察,物鏡測微尺與目鏡刻度尺重合的格數(shù)*0.01/目鏡刻度尺的格數(shù)即為物鏡在此倍率下每個(gè)刻度值的實(shí)際長度。
物鏡和目鏡加在一起標(biāo)定總放大倍數(shù)。用物鏡測微尺當(dāng)試樣看,上面有個(gè)1mm的尺子,分成100個(gè)小格,一個(gè)小格是10微米。你用帶有目鏡測微尺的目鏡去量上面標(biāo)尺的長度,量出來數(shù)值,除以1mm真實(shí)長度,不就知道放大倍數(shù)了么。經(jīng)常有單位說顯微鏡要讓計(jì)量局來計(jì)量。其實(shí)顯微鏡是分析儀器,不是強(qiáng)檢儀器。有時(shí)計(jì)量局來人計(jì)量,主要就是干這個(gè)活,計(jì)量你的放大倍數(shù)是不是在誤差之內(nèi)。