熒光顯微鏡是目前生物、醫(yī)療等領(lǐng)域的基礎(chǔ)儀器，和一般的光學(xué)顯微鏡相比，它的原理和參數(shù)指標(biāo)有所不同，今天我們就來帶大家了解下，熒光顯微鏡的原理及其應(yīng)用。

一、熒光顯微鏡原理

在熒光顯微鏡中，熒光指的是一種光致發(fā)光現(xiàn)象：某些分子能吸收特定波長的光線（激發(fā)光），然后再發(fā)射出其他波長的光線（發(fā)射光）的物理現(xiàn)象。這種分子稱為熒光團(tuán)，熒光團(tuán)的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間存在差值，發(fā)射光能量比發(fā)射光低，波長比激發(fā)光長，這個(gè)差值稱為“斯托克斯位移”。

熒光現(xiàn)象有兩種：自發(fā)熒光與繼發(fā)熒光。自發(fā)熒光是指樣品自帶熒光團(tuán)，經(jīng)照射后就能發(fā)出熒光，如葉綠體；繼發(fā)熒光也稱二次熒光，樣品經(jīng)照射后不能發(fā)出熒光，需先用熒光染料標(biāo)記處理，再經(jīng)照射才能發(fā)生熒光。熒光顯微鏡主要利用的是繼發(fā)熒光。

熒光成像包含激發(fā)和發(fā)射兩個(gè)過程，在熒光顯微鏡中體現(xiàn)為以下幾個(gè)關(guān)鍵部件：

（1）激發(fā)光源：提供激發(fā)光，有兩個(gè)主要指標(biāo) 

光譜覆蓋：需要較寬光譜，以覆蓋發(fā)射光譜。不同熒光團(tuán)需要不同波長的激發(fā)光，因此激發(fā)光源需要較寬的光譜，以覆蓋各種波長激發(fā)光的需要。如果應(yīng)用場景限定為真菌檢查等，也可能采用窄光譜的單通道激發(fā)光源，但這種顯微鏡無法滿足研究等應(yīng)用需要。

發(fā)射光強(qiáng)度：光源在不同波段的光強(qiáng)不同，理想狀態(tài)下發(fā)射光高強(qiáng)的波段要匹配熒光染料的激發(fā)峰值，較高亮度的激發(fā)光可產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光發(fā)射。現(xiàn)在主要用寬光譜、高光強(qiáng)的LED熒光光源

（2）激發(fā)塊：形成特異性激發(fā)/發(fā)射的濾光片組，在落射熒光顯微鏡中由三個(gè)部件組成

激發(fā)濾光片EX：只讓特定波長激發(fā)光通過，用以激發(fā)特定熒光染料

發(fā)射濾光片EM：匹配熒光染料特性，只讓特定波長的發(fā)射熒光通過

二向分色鏡DM：反射激發(fā)波段的光，透過發(fā)射波段的光。這是目前主流的落射熒光顯微鏡都有的部件，透射熒光顯微鏡沒有這個(gè)濾光片。

二、熒光顯微鏡的應(yīng)用

1、在生物學(xué)領(lǐng)域，熒光顯微鏡借助熒光染料標(biāo)記，可準(zhǔn)確而詳細(xì)地識(shí)別細(xì)胞和亞微觀細(xì)胞成分和活動(dòng)。

2、在醫(yī)療領(lǐng)域，熒光顯微鏡可借助熒光試劑，來檢測細(xì)菌、病毒的存在和分布，或?qū)ν饪颇繕?biāo)進(jìn)行輔助標(biāo)記方便手術(shù)進(jìn)行。

3、在礦物學(xué)領(lǐng)域，熒光顯微鏡常用于研究有自發(fā)熒光特性的物質(zhì)，如瀝青、石油、煤炭、氧化石墨烯等礦物。

4、在材料科學(xué)，熒光顯微鏡可用于紡織工業(yè)或造紙業(yè)來分析基于纖維的材料，包括紡織品和紙張

5、在半導(dǎo)體領(lǐng)域，熒光顯微鏡也可用來觀測具有熒光特性的材料如磁珠等。

熒光顯微技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)療領(lǐng)域中應(yīng)用是很廣泛也是很復(fù)雜的，樣品和目標(biāo)從肉眼可見的模式生物如斑馬魚，到光學(xué)顯微鏡無法看清外形的細(xì)菌病毒，都會(huì)涉及。針對(duì)不同樣品和目標(biāo)，需要考慮不同的熒光標(biāo)記策略，一是熒光染料能標(biāo)記的目標(biāo)，二是熒光染料對(duì)應(yīng)的激發(fā)特征，包括吸收光譜特征和發(fā)射光譜特征。借助熒光染料，熒光顯微鏡能針對(duì)的目標(biāo)不只局限于蛋白質(zhì)，還可以包含核酸、聚糖，甚至鈣離子等非生物物質(zhì)。