2023年2月23日，北京大學程和平-王愛民團隊在 Nature Methods 在線發(fā)表題為《Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection》 的文章。文中報道了重量僅為2.17克的微型化三光子顯微鏡，首次實現(xiàn)對自由行為小鼠的大腦全皮層和海馬神經(jīng)元功能成像，為揭示大腦深部結構中的神經(jīng)機制開啟了新的研究范式。

微型化三光子顯微鏡首次實現(xiàn)自由行為動物非侵入式深腦成像

海馬體位于皮層和胼胝體下面，在短期記憶到長期記憶的鞏固、空間記憶和情緒編碼等方面起重要作用。在嚙齒類動物研究模型中，海馬距離腦表面深度大于一個毫米。由于大腦組織特別是胼胝體，具有對光的高散射光學特性，所以突破成像深度極限是長期以來困擾神經(jīng)科學家的一個極大的挑戰(zhàn)。此前的微型化單光子及微型化多光子顯微鏡均無法實現(xiàn)穿透全皮層直接對海馬區(qū)進行無損成像。

由于腦組織是高散射介質，來自腦深層的熒光信號達到表面時已經(jīng)隨機散射。臺式三光子顯微鏡使用工作距離大于2mm、數(shù)值孔徑1.0的大尺寸物鏡，在滿足深層成像工作距離要求的同時保持足夠的熒光信號收集效率。但在微型探頭中，如果物鏡工作距離為2mm，使用大數(shù)值孔徑物鏡，探頭重量和體積就比較大，無法滿足自由行為小鼠對于探頭重量和體積的要求。

因此，解決這一問題的關鍵是在減小物鏡數(shù)值孔徑情況下，保持足夠的熒光收集效率。

此次微型化三光子顯微鏡的研發(fā)將經(jīng)典阿貝聚光鏡結構引入探頭光學構型設計中，將微型阿貝聚光鏡與簡化的無限遠物鏡密接以提高散射熒光收集效率，同時在激發(fā)光路引入李斯特物鏡作為管鏡補償簡化物鏡的像差，并通過將阿貝聚光鏡與李斯特管鏡部分復用，實現(xiàn)探頭體積的減小。新微型化顯微鏡構型在工作距離1.75mm、數(shù)值孔徑0.65、物鏡直徑僅3.4mm時，實現(xiàn)了與臺式三光子顯微鏡熒光收集效率相當?shù)乃健?/p>

在全球，該微型化三光子顯微鏡首次實現(xiàn)了自由行為動物非侵入式深腦成像解決方案，可穿透小鼠大腦全皮層和胼胝體，實現(xiàn)對海馬CA1亞區(qū)的直接觀測記錄，避免植入式Grin Lens損傷腦組織。神經(jīng)元鈣信號*大成像深度可達1.2mm，血管成像深度可達1.4mm。同時，微型化三光子顯微鏡實現(xiàn)全皮層鈣信號成像僅需幾毫瓦，海馬鈣信號成像僅需20-50mw，大大低于組織損傷的安全閾值。

嶄露頭角——2.2克微型化雙光子顯微鏡，實現(xiàn)自由行為小鼠腦成像

在多光子成像領域，這支來自北大的團隊已深耕多年。

2017年，程和平院士領導的北大交叉團隊成功研制出**代2.2克微型化雙光子顯微鏡FHIRM-TPM，在全球首次實現(xiàn)了自由運動小鼠單個樹突棘水平神經(jīng)元功能活動的高速、高分辨率實時成像。該微型化雙光子顯微鏡可實時記錄自由行為動物的大腦神經(jīng)元和樹突棘活動，支持鈣成像，并可在同一視野長時程反復成像。

此前，在用臺式雙光子顯微鏡研究活體小鼠腦活動時，需先麻醉小鼠并將其頭部固定。這種情況下，小鼠不能自由運動，無法研究如打斗、哺乳及社交行為，懸尾實驗、電擊實驗等研究受限。此外，臺式雙光子顯微鏡不便移動且占用面積較大。

隨著科技的發(fā)展，部分研究人員引入虛擬現(xiàn)實技術，在小鼠面前放一個顯示器，并將小鼠放在跑步機上，在跑的過程中投放虛擬場景并觀察小鼠腦活動。但這種方法也飽受爭議。其一，在虛擬現(xiàn)實和現(xiàn)實情景中，小鼠大腦神經(jīng)元的反應情況不一定完全相同；其二，動物在頭部固定的情況下會有情緒上的壓力，還可能出現(xiàn)應激反應。

據(jù)吳潤龍介紹，北大團隊的微型化雙光子顯微鏡主要有以下幾方面突破，一是飛秒激光的柔性傳輸，普通的光纖在傳輸飛秒激光時具有很強的色散和非線性效應，導致雙光子激發(fā)效率變低，北大團隊開發(fā)了一種新型空心光子晶體光纖，可以無失真地傳輸920nm飛秒激光，從而高效地進行綠光熒光蛋白雙光子激發(fā)。

二是成像物鏡，傳統(tǒng)物鏡直徑在20mm左右，重量比一般小鼠還重，北大團隊開發(fā)的微型物鏡直徑為3.5mm、長10mm，內部有上十個鏡片組合，分辨率依然可以達到衍射極限；三是高速成像，為了減少運動帶來的偽影，需要快速地進行成像，北大團隊通過高速MEMS掃描振鏡，在微型化上實現(xiàn)了視頻級的成像速度。*后，各項技術的高質量集成，構成了2.2g的高時空分辨微型化雙光子探頭。

全球范圍內，這款“戴著跑”的微型化雙光子顯微鏡**次實現(xiàn)了自由行為動物的清晰穩(wěn)定成像，可用于在動物覓食、跳臺、打斗、嬉戲、睡眠等自然行為條件下，或者在學習前、學習中和學習后，長時程觀察神經(jīng)突觸、神經(jīng)元、神經(jīng)網(wǎng)絡、遠程連接的腦區(qū)等多尺度、多層次動態(tài)變化，從而獲取小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動的動態(tài)圖像。

諾貝爾生物學或醫(yī)學獎獲得者愛德華·莫索爾（Edvard.I. Moser）博士曾稱這款顯微鏡是神經(jīng)科學研究領域中的一個“革命性”新工具。

持續(xù)深耕——拓寬腦科學研究的邊界，應用場景不斷升級

2021年，這支北大團隊推出了第二代微型化雙光子顯微鏡FHIRM-TPM 2.0，將成像視野擴大了7.8倍，成像的橫向分辨率、軸向分辨率比**代顯微鏡高約1.5倍，同時具備獲取大腦皮層上千個神經(jīng)元功能信號的三維成像能力。

除在核心性能上實現(xiàn)升級外，新一代微型化雙光子顯微鏡采用整機一體化設計，滿足更小空間實驗室的應用。同時具有較強的兼容性，內置激光適配模塊，可匹配市面上所有品牌的飛秒激光器，以更強大的成像性能、更廣泛的適配性能及更便捷的操作性能為成像技術的發(fā)展帶來新的活力。

基于微型化雙光子顯微鏡，北大團隊與浙江大學的胡海嵐團隊、中科院孫衍剛團隊等開展合作。如孫衍剛團隊在研究癢覺感知神經(jīng)機制，由于癢覺出現(xiàn)過程非?？臁⑸窠?jīng)元發(fā)放也很快，而且不同比例的神經(jīng)元在癢覺感知的不同階段出現(xiàn)，這要求成像設備不僅需要快速記錄單個神經(jīng)元，還需具備高空間分辨率以區(qū)分兩類神經(jīng)元。

此前，大腦皮層對癢覺感知的編碼機制的研究多在麻醉動物中進行，這種情況下動物無法通過抓撓行為報告對癢覺的感知。通過微型化雙光子顯微鏡，孫衍剛團隊在小鼠自由活動時實現(xiàn)了單細胞分辨率的鈣成像，為癢覺機制的研究提供了新的方案。

在應用場景上，北大團隊也一直在突破極限。2022年，團隊攻克了航天極端環(huán)境機體應激與防護等多項技術難題，研制出空間站雙光子顯微鏡。據(jù)程和平院士此前的介紹：“在軌實驗儀器設備對可靠性、體積、重量、抗沖擊和振動性能等有著更苛刻的要求，要想研制出能夠進入太空的雙光子顯微鏡并非易事?！?/p>

近日，神舟十五號的航天員使用其空間站雙光子顯微鏡，成功獲取皮膚表皮及真皮淺層的三維圖像，可用于航天員的在軌健康監(jiān)測。

科研成果產(chǎn)業(yè)化的關鍵一步，

搭建可控的供應鏈

王愛民提出，由于綜合技術等原因，目前全球范圍內為數(shù)不多的課題組在研究微型化雙光子顯微鏡，只有更多參與者加入，才能更快地推廣技術、做大產(chǎn)業(yè)。

創(chuàng)新技術的大規(guī)模推廣離不開產(chǎn)業(yè)化。以中國科學院院士及北京大學生物學、醫(yī)學、物理學和生理學等多學科專家為背景成立的北京超維景生物科技有限公司（以下簡稱“超維景”）實現(xiàn)了科研成果的產(chǎn)業(yè)轉化。目前，超維景在北京、南京兩地的團隊人數(shù)已超100人，吸引了在生產(chǎn)、注冊、市場推廣等領域經(jīng)驗豐富的產(chǎn)業(yè)人士加入。

從科研項目走向產(chǎn)業(yè)化，除了企業(yè)自身的技術積累、差異化產(chǎn)品創(chuàng)新、工藝流程控制外，可控的供應鏈是關鍵因素之一。

據(jù)王愛民回憶，曾經(jīng)我們做的**個“商業(yè)化試水”的項目是雙光子光片顯微鏡，其中的一個核心部件變焦透鏡只有一家美國公司可以提供，在我們做科研、小范圍應用時，可以正常買到，但當我們決定產(chǎn)業(yè)化后，這家美國公司便不提供了，這也就直接導致項目“夭折”。

在此后的產(chǎn)業(yè)化進程中，超維景選擇“自力更生”加“內外合力”的模式。一是自主研發(fā)逐步實現(xiàn)雙光子顯微鏡產(chǎn)品核心零部件國產(chǎn)化；二是聯(lián)合國內相關產(chǎn)業(yè)的參與者，由他們根據(jù)需求開發(fā)新技術。

目前，超維景已建立起可控的產(chǎn)業(yè)鏈，如飛秒激光器、空心光纖、微型化物鏡等都已實現(xiàn)國產(chǎn)化，為公司后續(xù)醫(yī)療產(chǎn)品線的發(fā)展打下堅實基礎，不僅在研發(fā)、生產(chǎn)等環(huán)節(jié)實現(xiàn)自主可控，還可大大降低生產(chǎn)成本。

兩條腿走路，

邁出科研設備的“舒適區(qū)”

王愛民提出：“中國腦科學起步較晚，市場不足美國的十分之一，但是2021年中國腦計劃正式啟動，預計5年500億的投入?！?同時，雙光子顯微成像應用于在體病理的研究和應用工作在全球也開展近20年，雙光子作為活體成像利器應用于臨床診斷研究也展示了應用潛力。超維景堅持科研設備、醫(yī)療器械兩條腿走路，力求實現(xiàn)從動物到人，更大程度地造福人體健康。

手持式皮膚生物細胞檢測儀是公司的首次“試水”。該產(chǎn)品以微型化雙光子顯微成像技術為基礎，實現(xiàn)在體、原位、無創(chuàng)、無標記的微納米級顯微成像，細胞、彈性纖維、膠原纖維、代謝信息等清晰可見。

手持式皮膚生物細胞檢測儀主要有兩大應用市場。一是臨床的應用，在院內進行實時在體的檢測。目前院內疾病診斷的金標準是病理檢查，需從人體切下一小塊組織送檢，操作有創(chuàng)且需等待一段時間（一般是3-5天）才能得到檢查結果。而很多情況下臨床需要快速決策、定期監(jiān)測，如黑色素瘤、皮膚癌等定期檢查。通過手持式皮膚生物細胞檢測儀，醫(yī)生可隨時監(jiān)測細胞形態(tài)的變化，觀察患者病情變化，以調整治療計劃。

二是皮膚功效檢測的應用，超維景正在開展皮膚圖譜研究，可用于化妝品、醫(yī)美技術的評估。據(jù)王愛民介紹，化妝品提到幫助改善肌膚狀態(tài)，但其中并沒有客觀標準，我們可直接基于對皮膚細胞的觀察，檢測其中的彈性纖維、膠原纖維，推出客觀的皮膚年齡標準，用于評估化妝品的有效性。

在醫(yī)療領域，超維景在開發(fā)3D 4K熒光內窺鏡，在傳統(tǒng)內窺鏡的基礎上加入細胞成像功能，使醫(yī)生看到更多信息，進一步推動**診斷。

王愛民提到：“新技術的推廣市場教育非常重要，尤其是在保守謹慎的醫(yī)療市場。我們要先充分理解醫(yī)生的使用習慣再去設計產(chǎn)品，創(chuàng)新技術要變成對醫(yī)生而言真正好用的產(chǎn)品?！蹦壳?，超維景正在跟301醫(yī)院合作，開發(fā)一次性內窺鏡，用于消化道早癌的篩查、診斷；公司也在與協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科聯(lián)合開展宮頸癌早篩方面的研究。

腦科學，無疑是近年來醫(yī)療領域*火的命題之一。

人類腦部結構錯綜復雜，包含千億個神經(jīng)元，至今科學家都仍在探索情緒、感情等發(fā)生機制。成像技術是腦科學研究發(fā)展的關鍵。從CT、MRI到PET等成像技術，都是為做到“眼見為實”。人類不斷追求，在新鮮樣本、甚至是活體上直接進行高分辨率成像。多光子顯微成像技術在成像分辨率、速度、深度等多方面具有較大優(yōu)勢，賦能腦科學研究。

同時將進一步揭示腦疾病發(fā)病機制及指導檢測治療方法的開發(fā)。如癲癇、帕金森、阿爾茲海默等神經(jīng)系統(tǒng)疾病所帶來的社會負擔、經(jīng)濟負擔重，且持續(xù)周期長，缺少有效的治療手段。如果能在疾病機制上有一些新的發(fā)現(xiàn)，做到早防早治，可極大地減輕社會負擔。

再者，成像技術必將與數(shù)字技術特別是人工智能技術緊密結合，“AI+”的成像系統(tǒng)將進一步提高臨床醫(yī)生的診療水平。

綜合來看，多光子顯微成像技術擁有“科研+臨床”的廣闊應用空間，將成為人類在腦科學研究海域中的一座燈塔，照亮更多隱秘的角落。

參考文章：

《你為什么會癢？中科院研究揭示癢覺表征和感知的神經(jīng)機制》——澎湃新聞

《【科技前沿】北京大學程和平/王愛民團隊研制成功微型化三光子顯微鏡》——中國生物物理學會

《多光子顯微成像技術在腦部疾病研究中的應用》——黃燕霞、周非凡、周婷、許皓、林丹櫻、屈軍樂

《Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection 》——《Nature Methods》

《世界首次！北大研制空間站雙光子顯微鏡獲取航天員皮膚三維圖像》——北京大學

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