熒光顯微鏡不是通過(guò)普通光源的照射來(lái)觀察標(biāo)本，而是利用一定波長(zhǎng)的光（通常是紫外光、藍(lán)紫光）在顯微鏡下激發(fā)標(biāo)本中的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，所以，熒光顯微鏡光源的作用不是直接照射，而是作為能量源激發(fā)標(biāo)本內(nèi)部的熒光物質(zhì)。我們之所以能觀察到標(biāo)本，是由于光源的照射，而是標(biāo)本中的熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光能后呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象。

熒光顯微鏡的原理是什么?

與普通光學(xué)顯微鏡不同，熒光顯微鏡不是通過(guò)普通光源的照射來(lái)觀察標(biāo)本，而是利用一定波長(zhǎng)的光（通常是紫外光、藍(lán)紫光）在顯微鏡下激發(fā)標(biāo)本中的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，所以，熒光顯微鏡光源的作用不是直接照射，而是作為能量源激發(fā)標(biāo)本內(nèi)部的熒光物質(zhì)。我們之所以能觀察到標(biāo)本，是由于光源的照射，而是標(biāo)本中的熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光能后呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象。

由此可見(jiàn)，熒光顯微鏡的主要特點(diǎn)是它的光源可以在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)提供大量的激發(fā)光，使被測(cè)樣品中的熒光物質(zhì)能夠獲得被測(cè)物的激發(fā)光。必要的強(qiáng)度。同時(shí)，熒光顯微鏡必須有相應(yīng)的濾光系統(tǒng)。

熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的重要工具。它由超高壓光源、濾光系統(tǒng)（包括激發(fā)和加壓濾板）、光學(xué)系統(tǒng)和照相系統(tǒng)等主要部件組成。它利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。

激發(fā)熒光的方式：根據(jù)光的波長(zhǎng)范圍分為UV激發(fā)法（使用紫外照射法）和BV激發(fā)法（使用藍(lán)紫光）。紫外激發(fā)法使用短于 400 nm 的近紫外光進(jìn)行激發(fā)。該方法沒(méi)有可見(jiàn)的激發(fā)光，因此觀察到的熒光表現(xiàn)出染料的固有熒光，很容易區(qū)分標(biāo)本上的特異性熒光和背景組織的自發(fā)熒光。

BV激發(fā)法是從紫外光激發(fā)到以404nm和434nm為中心的藍(lán)光。這種方法使用藍(lán)光照射標(biāo)本，因此熒光觀察系統(tǒng)的截止濾光片必須使用能夠完全阻擋藍(lán)光并完全通過(guò)所需的綠色和黃色熒光的濾光片。用于熒光抗體測(cè)定的熒光染料。激發(fā)光的Z大吸收波長(zhǎng)與熒光的Z大發(fā)射波長(zhǎng)比較接近，所以BV激發(fā)法中使用的濾光片必須使用銳截止濾光片。該方法可以使用藍(lán)光作為激發(fā)光，因此熒光染料的吸收效率高，可以獲得更亮的圖像。缺點(diǎn)是500nm以下看不到熒光，500nm以上會(huì)使整個(gè)圖像呈現(xiàn)黃色。在熒光抗體法中，大部分熒光染料都是獨(dú)特的。因此，在討論細(xì)微特異性時(shí)，上述 BV 激發(fā)方法的缺點(diǎn)往往影響很大。

綜上所述，熒光顯微鏡的照明根據(jù)聚光鏡的結(jié)構(gòu)和激發(fā)光的波長(zhǎng)可以分為以下三點(diǎn)。

1.從熒光圖像的對(duì)比度要求來(lái)看，紫外激發(fā)的暗場(chǎng)聚光鏡適合照明。

2.考慮到圖像的亮度，BV激發(fā)濾光片的暗場(chǎng)觀察效率高。

3.UV激發(fā)濾光片暗場(chǎng)觀察和BV激發(fā)暗場(chǎng)聚光鏡照明的特點(diǎn)可以說(shuō)是介于這兩種照明方式之間，但前者的濾光片暗場(chǎng)特性更強(qiáng)，顯示的圖像更亮，對(duì)比度小；后者保留了暗場(chǎng)光路的特性，因此顯示圖像更暗，對(duì)比度提高。實(shí)際使用熒光顯微鏡時(shí)，應(yīng)使用適合標(biāo)本要求的照明方法進(jìn)行觀察。

必須指出的是，即使是用對(duì)比度好的紫外激發(fā)暗場(chǎng)聚光器照射時(shí)，被試樣折射或散射的部分紫外激發(fā)光也會(huì)進(jìn)入物鏡，使加膠面和光學(xué)玻璃中的加膠面光學(xué)系統(tǒng)會(huì)受到激發(fā)的影響，產(chǎn)生的自發(fā)熒光會(huì)使圖像的響應(yīng)變差。因此，必須在目鏡前使用吸收紫外線的濾光片作為截止濾光片。